Deeptools ngs analysis

deepTools 是处理与可视化高通量测序数据的命令行工具集：把 BAM 比对转成归一化覆盖度轨道（bigWig），做质控（相关性、PCA、指纹），并在基因组特征（TSS、peak、基因体）周围生成热图与谱图。支持 ChIP-seq、RNA-seq、ATAC-seq、MNase-seq。

何时使用

适用：

• 把 BAM 转成归一化 bigWig 覆盖度轨道。
• 对比 ChIP treatment 与 input，生成 log2 比值轨道。
• 评估样本质量：重复间相关性、PCA、覆盖深度、ChIP 富集强度（指纹图）。
• 在 TSS、peak 或其它区间周围绘制热图与谱图。
• ATAC-seq 的 Tn5 偏移校正；RNA-seq 链特异性覆盖。

不该用（负边界）：

• 读段比对 → 用 STAR / BWA / bowtie2。
• peak calling → 用 MACS2 / HOMER。
• BAM/VCF 编程级操作（自定义过滤等）→ 用 pysam。

步骤

1. 安装并校验：pip install deeptools，bamCoverage --version。
2. 准备输入：BAM 必须已排序且建索引（存在 .bai，缺失则 samtools index input.bam）；区间用标准 3+ 列 BED。
3. 先做质控（相关性 + 指纹），富集差则别浪费时间往下走。
4. BAM→归一化 bigWig；必要时 bamCompare 生成比值轨道。
5. computeMatrix 计算特征区信号矩阵，再 plotHeatmap / plotProfile 出图。

指令

BAM→覆盖度（bamCoverage）：

# RPGC 归一化（ChIP/ATAC 推荐，需基因组有效大小）
bamCoverage --bam input.bam --outFileName output.bw \
    --normalizeUsing RPGC --effectiveGenomeSize 2913022398 \
    --binSize 10 --numberOfProcessors 8 \
    --extendReads 200 --ignoreDuplicates

# CPM 归一化（无需基因组大小，适合快速比较）
bamCoverage --bam input.bam --outFileName output.bw \
    --normalizeUsing CPM --binSize 10 -p 8

# RNA-seq 链特异性覆盖（切勿用 --extendReads，会跨剪接位点）
bamCoverage --bam rnaseq.bam --outFileName forward.bw \
    --filterRNAstrand forward --normalizeUsing CPM -p 8

样本比较（bamCompare）：

# log2 比值 treatment/control
bamCompare -b1 treatment.bam -b2 control.bam -o log2ratio.bw \
    --operation log2 --scaleFactorsMethod readCount --extendReads 200 -p 8

质控：

# 相关性热图（重复应聚类，r>0.9 为佳）
multiBamSummary bins --bamfiles rep1.bam rep2.bam rep3.bam \
    -o counts.npz --binSize 10000 -p 8
plotCorrelation -in counts.npz --corMethod pearson --whatToShow heatmap -o correlation.png
plotPCA -in counts.npz -o pca.png

# ChIP 富集指纹（曲线陡升=好；接近对角线=富集差）
plotFingerprint -b input.bam chip.bam -o fingerprint.png --extendReads 200 --ignoreDuplicates

热图与谱图：

# reference-point：TSS 周围信号
computeMatrix reference-point -S chip.bw -R genes.bed \
    -b 3000 -a 3000 --referencePoint TSS -o matrix.gz -p 8
# scale-regions：跨基因体信号
computeMatrix scale-regions -S chip.bw -R genes.bed \
    -b 1000 -a 1000 --regionBodyLength 5000 -o matrix.gz -p 8

plotHeatmap -m matrix.gz -o heatmap.png --colorMap RdBu --kmeans 3 --sortUsing mean
plotProfile -m matrix.gz -o profile.png --plotType lines --perGroup

读段过滤 / ATAC 校正（alignmentSieve）：

# 按比对质量与片段长度过滤
alignmentSieve --bam input.bam --outFile filtered.bam \
    --minMappingQuality 10 --minFragmentLength 150 --maxFragmentLength 700

# ATAC-seq Tn5 偏移校正（+4/-5 bp），随后必须重新索引
alignmentSieve --bam atac.bam --outFile shifted.bam --ATACshift
samtools index shifted.bam

关键概念——归一化方法：

方法	含义	何时用	依赖
RPGC	1× 全基因组覆盖	ChIP-seq、ATAC-seq	--effectiveGenomeSize
CPM	每百万计数	任意、快速比较	无
RPKM	每 kb 每百万	RNA-seq 基因水平	无
BPM	每百万 bins	类似 CPM	无

常用基因组有效大小：人 GRCh38=2,913,022,398；小鼠 GRCm38=2,652,783,500；斑马鱼 GRCz11=1,368,780,147；果蝇 dm6=142,573,017；线虫 ce11=100,286,401。

computeMatrix 两种模式：reference-point（围绕固定点 TSS/peak summit，参数 -b/-a/--referencePoint）；scale-regions（跨变长特征如基因体，参数 -b/-a/--regionBodyLength）。

示例

ChIP-seq 质控 + 可视化完整流程：

#!/bin/bash
CHIP="chip.bam"; INPUT="input.bam"; GENES="genes.bed"; PEAKS="peaks.bed"
GSIZE=2913022398; THREADS=8

# 1. 质控：相关性
multiBamSummary bins --bamfiles $INPUT $CHIP -o summary.npz -p $THREADS
plotCorrelation -in summary.npz --corMethod pearson --whatToShow heatmap -o correlation.png
# 2. 质控：富集指纹
plotFingerprint -b $INPUT $CHIP -o fingerprint.png --extendReads 200 --ignoreDuplicates
# 3. 归一化 bigWig
bamCoverage --bam $CHIP --outFileName chip.bw --normalizeUsing RPGC \
    --effectiveGenomeSize $GSIZE --extendReads 200 --ignoreDuplicates -p $THREADS
# 4. log2 比值轨道
bamCompare -b1 $CHIP -b2 $INPUT -o log2ratio.bw --operation log2 \
    --scaleFactorsMethod readCount --extendReads 200 -p $THREADS
# 5. TSS 热图
computeMatrix reference-point -S chip.bw log2ratio.bw -R $GENES \
    -b 3000 -a 3000 --referencePoint TSS -o tss_matrix.gz -p $THREADS
plotHeatmap -m tss_matrix.gz -o tss_heatmap.png --colorMap RdBu --kmeans 3

ATAC-seq 流程关键步骤：

# 1. Tn5 校正并索引
alignmentSieve --bam atac.bam --outFile shifted.bam --ATACshift -p 8
samtools index shifted.bam
# 2. RPGC 覆盖（小 binSize）
bamCoverage --bam shifted.bam --outFileName atac.bw \
    --normalizeUsing RPGC --effectiveGenomeSize 2913022398 --binSize 5 --extendReads -p 8
# 3. 核小体周期性（应见 ~200/400bp 峰）
bamPEFragmentSize -b shifted.bam -o fragsize.png --maxFragmentLength 1000 --binSize 1

注意事项

• ChIP-seq 务必扩展读段：--extendReads 200（或实际片段长度），ChIP 片段比读段长。
• RNA-seq 绝不扩展读段：--extendReads 会跨剪接位点产生伪影；若 exon 边界出现伪影，移除该参数。
• 同一比较内所有样本必须用相同归一化方法，反例混用会得到错误结论。
• 用 RPGC 必须给 --effectiveGenomeSize，否则静默产生错误结果。
• 调参先用 --region chr1:1-10000000 在单染色体上试跑，省下数小时。
• 几乎所有工具都支持 -p / --numberOfProcessors，用满可用核。
• 常见报错：BAM index not found → samtools index；内存溢出 → 增大 --binSize 或限定 --region；bigWig 过大 → 增大 binSize；指纹平坦 → ChIP 富集差（生物学问题，考虑重做实验）；BAM 与 BED 基因组版本不一致（hg38 vs hg19）会导致错误。

互见

• pysam-genomic-files — deepTools 之前用代码自定义过滤 BAM/VCF。
• matplotlib-scientific-plotting — 对 deepTools 出图做超出内置选项的定制。
• 官方文档：https://deeptools.readthedocs.io/ ；参考文献 Ramirez et al. (2016) deepTools2, NAR, https://doi.org/10.1093/nar/gkw257 。

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采编自 jaechang-hits/SciAgent-Skills（CC-BY-4.0）。